Les protocoles expérimentaux évoluent au gré des expérimentations et des expérimentateurs. Du fait, de cette évolution perpétuelle et de l'absence de protocole standard, les comparaisons sont malaisées. Le protocole expérimental permet en effet d'orienter les résultats d'une enquête dans le sens où une dizaine de ruches ne sont pas forcément représentatives d'un phénomène. Pour autant, les protocoles expérimentaux se précisent et un protocole qui conduit à l'évaluation de la toxicité des pesticides sur les larves d'abeilles a dernièrement été mis au point par l'INRA. Ce test concernant les larves d'abeilles cultivées in vitro était tout bonnement inexistant au moment des dossiers Gaucho et Régent. Il s'agissait d'un réellement manquement dans la mesure où il est impossible d'extrapoler aux larves les effets de la substance active observés sur les adultes. Néanmoins, ce manquement n'est encore comblé qu'au niveau national. Jean-Noël Tasei, scientifique à l'INRA, explique que le test n'est pas encore accepté au niveau européen parce qu'il faut encore démontrer la fiabilité incontestable du protocole. Pour cela, un test circulaire va prochainement être mené. Il s'agit de faire faire les manipulations concernant une molécule par différents laboratoires pour voir si l'utilisation du même protocole conduit à des résultats identiques.

     Au niveau national, la Commission des Essais Biologiques, habilitée pour valider les méthodes d’expérimentation des tests, a validé le test développé par des chercheurs de l’INRA et a exigé des chercheurs pour mener leur expertise au plus proche des conditions d’utilisation des phytosanitaires. En France, ce test est donc obligatoire en vue d’obtenir toute autorisation de mise sur le marché d’une préparation phytopharmaceutique. Ce test sera ensuite proposé au niveau européen entre 2008 et 2009.

     Le nouveau test a établi une méthode d’élevage des larves standardisées in vitro. Alors qu’en conditions naturelles, les larves peuvent ingérer des pesticides en quantité inconnue, le test in vitro permet d’introduire dans le milieu nutritif le pesticide testé en concentrations connues, soit environ 30 microlitres de milieu. On peut donc déterminer la dose de pesticide ingérée par les larves disposées dans des cupules en plastiques imitant les alvéoles de la ruche.

     Le produit peut être testé pendant les 6 à 7 jours que dure la vie larvaire avant le passage au stade nymphal. Mais les morts tardives sont aussi relevées sur les nymphes et adultes. La mortalité est détectée par l’immobilisme des larves, suivie d’une décomposition rapide de la larve, en 1 heure environ. Les chercheurs pèsent également les larves avant la nymphose et décèlent ainsi tout retard de croissance et de développement. La toxicité d’un insecticide se détermine au regard d’un insecticide de référence : le diméthoate dont la toxicité est élevée et reconnue pour l’abeille domestique.

     Les méthodes expérimentales d'évaluation des risques des pesticides sur l'abeille se standardisent afin que les acteurs puissent utiliser le même langage et les mêmes données. Si le test de l'INRA prend mieux en compte l'abeille en s'intéressant particulièrement aux larves, un seul mode d'intoxication est pris en compte. En effet, l'intoxication par ingestion est évaluée alors que la pénétration dans le tégument ne l'est pas. Le test repose par ailleurs sur le présupposé que la toxicité n’est réelle que dans certaines conditions d’utilisation ou à partir d’un certain seuil de pesticide ingéré.